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引言
單特異性抗體（monospecific antibody）是針對單一抗原表位、由單一細胞克隆制備的高度均一的抗體（簡稱：單抗）。自1975年K?hler與Milstein建立雜交瘤技術以來[1]，治療性單抗經歷了鼠源、人源化到全人源的演進，并于1986年誕生了首個獲批的治療性單抗。經過近40年的發展，單抗已成為生物藥中體量最大、技術最成熟的類別之一，廣泛用于腫瘤、自身免疫病及感染性疾病等領域。
但單抗有一個先天局限：一個分子只識別一個靶點（或表位）。而腫瘤和免疫疾病的信號網絡從來不是"單車道"，僅阻斷單一靶點往往不足以扭轉復雜的疾病進程。
雙特異性抗體（bispecific antibody, BsAb，簡稱：雙抗）正是為突破這一局限而生：它通過基因工程手段構建，能夠同時特異性識別并結合兩個不同的抗原表位。這一概念可追溯至20世紀60年代Nisonoff等對雙特異性抗體片段的重組探索[2]。2009年，Catumaxomab（EpCAM×CD3）在歐盟獲批，成為全球首個上市的雙抗；2014年，Blinatumomab（CD19×CD3）獲美國FDA批準；2017 年，Emicizumab（FIXa×FX）獲批用于A型血友病，標志著雙抗從腫瘤領域拓展至非腫瘤領域[3]。截至 2026年，全球已有20余款雙抗獲批上市，另有數百個雙抗項目處于臨床開發階段；在國內，康方生物自主研發的Cadonilimab（PD-1×CTLA-4）于 2022 年 6 月獲批，成為首個上市的國產雙抗，2024年5月Ivonescimab（PD-1×VEGF）獲批上市，進一步推動了雙抗研發熱潮。
用一個分子同時結合兩個靶點，帶來的是單抗（甚至單抗聯合療法）難以復制的六大優勢[3]：
① 一個分子，同步阻斷兩條通路。 PD-1×VEGF、PD-1×CTLA-4 這類組合，單抗需要兩藥聯用；雙抗一次給藥即可同步阻斷，不存在兩藥暴露不同步的問題。
② 協同結合，選擇性更好。 部分雙抗通過調整與抗原的親和力，能夠在只有兩個靶點同時存在的組織中才表現出高親合力（avidity 效應），在僅表達單一靶點的正常組織中則容易解離。這相當于給藥物裝上了"AND 邏輯門"，對雙陽性組織中的靶向性更強，減少on-target off tumor毒性的發生，治療窗更寬。
③ 免疫細胞銜接器（T cell engager, TCE）。 CD3×腫瘤抗原類雙抗可以直接把T細胞"拉到"腫瘤細胞旁邊，形成免疫突觸，這是單抗無法實現的機制。
④ 橋接內源性因子。 Emicizumab（FIXa×FX）模擬凝血因子Ⅷ的功能，把兩個本不直接結合的蛋白"焊接"到一起，替代缺失的天然輔因子。單抗只能"阻斷"，雙抗還可以"搭建"。
⑤ 聯合療法的"一體化交付"。 兩藥聯用意味著兩條CMC產線、兩項臨床試驗、一套藥物相互作用研究、兩份說明書，以及患者雙重的用藥依從性負擔；雙抗則將其壓縮為一個分子、一次開發、一份上市申請，對企業和患者都是數量級的簡化。
⑥ 更大的克服耐藥空間。 腫瘤逃逸的常見機制是靶點丟失（antigen loss）。兩個靶點同時丟失的概率顯著低于單靶點，HER2雙表位、EGFR×c-Met等設計天然帶有"防逃逸"屬性。
雙抗的三大典型作用機制歸納見圖 1。
圖1 雙特異性抗體的三大典型作用機制
2 雙特異性抗體的結構分類 雙抗的結構格式目前已有上百種，但總體可歸為兩大類：片段型結構（fragment-based structures）與IgG樣結構（IgG-like structures）。兩類結構在藥理活性、表達穩定性和藥代動力學特性方面差異顯著，是理解雙抗PK行為的第一步[3]。 1. 片段型結構BsAb 片段型結構通過分子設計將多個抗原結合單元組裝在沒有Fc段的分子上（如 BiTE、DART、納米抗體衍生的多價片段等）。這類結構避免了輕重鏈錯配問題，分子量小、腫瘤滲透性好、免疫原性相對較低；由于缺乏Fc段，不具備也同時缺失了 Fc介導的效應功能（ADCC、ADCP、CDC），減少細胞因子風暴（CRS）等毒性反應發生的風險，但同時也缺失了FcRn介導的循環回收效應，因此清除速度快、半衰期較短（可僅有數小時），通常需要頻繁給藥。如前文提到目前仍在售的首個獲批雙抗Blinatumomab，即屬于此類結構，臨床應用時需要28天連續靜脈輸注。 2. IgG 樣結構BsAb 在早期片段性結構BsAb成功開發的基礎上，目前的雙抗藥物開發大多傾向于IgG樣結構，保留了天然抗體分子的Fc段，具有與IgG相近的穩定性和Fc介導的效應功能。這類雙抗通過Fc段與受體FcRn結合而獲得循環回收，半衰期相對更長，在給藥頻次方面更具優勢，更適合需要長期維持治療的適應癥。對于容易發生CRS的TCE類藥物，常使用沉默的Fc段，即僅保留其與受體FcRn結合功能，獲得長半衰期。 總體而言，結構格式的選擇決定了分子大小、清除速率、半衰期與免疫原性，進而直接影響給藥途徑與給藥方案的設計。 3 雙抗的藥代動力學研究 與單抗相比，雙抗的PK特征更為復雜，其復雜性貫穿于非臨床種屬選擇、試驗設計、生物分析與免疫原性評價的各個環節。 1. 非臨床動物種屬選擇 抗體類藥物的臨床前動物種屬選擇通常依據藥效學實驗確定，即通過體外實驗測定藥物與靶點的親和力或體外活性，選定相關動物種屬。對雙抗而言，若需要找到與兩個靶點均有較高親和力的相關動物種屬，這為臨床前動物種屬選擇帶來了額外挑戰[4]-[5]。 2. 非臨床PK試驗內容 雙抗的非臨床藥代研究內容通常包括[4]： 單次給藥PK：設3~4個劑量組，表征暴露量隨劑量的線性/非線性特征及半衰期（t1/2）； 重復給藥PK：一般整合到重復給藥毒性試驗中，以毒代動力學（TK）形式開展； 分布：與單抗類似，由于分子量較大，一般認為雙抗主要分布于循環系統，通常不單獨開展分布研究；若為局部給藥或片段型雙抗等，通常會開展組織分布研究考察靶組織滯留與全身暴露。 消除：抗體藥物降解產物一般是小肽與氨基酸，可被體內重新利用，通常不開展代謝與排泄的專項研究。 3. PK 生物分析要點 （1）背景與方法設計挑戰 藥物的藥代動力學評價是通過測定血液循環中不同分子形式藥物的濃度來實現的，因此，可靠、穩健且可重復的PK生物分析方法對雙抗的PK評價至關重要[6]。雙抗作為一類具有雙功能結合活性的抗體藥物，具有多個結合位點和復雜的作用機制，在體內可存在多種分子形式，主要包括完整游離型（free）、部分結合型（partial bound）和完整結合型（total bound），且活性形式與非活性形式在生物基質中共存。FDA對于雙抗藥物開發的指導原則中，在臨床藥理學研究部分明確指出：雙抗在生物基質中可能以具有生物活性形式（例如未結合且能夠結合配體）與無生物活性形式（例如已結合且無法結合配體）的混合物形式存在。應考慮確定對藥代動力學/藥效學評估最具相關性的雙特異性抗體形式，并開發經過驗證的檢測方法以相應地測定該特定形式。這為生物分析方法的設計帶來了挑戰：方法設計時需綜合考慮藥物結構特點、靶點情況、作用機制及其特征、體內各分子形式的穩定性、技術可行性以及監管要求[6]-[7]。 （2）檢測策略 由于雙抗在體內存在多種形式，檢測策略制定時需將活性與非活性形式一并納入考慮，可能需要建立不同的生物分析方法以滿足不同分子形式的檢測需求，可能包括free、total bound及partial bound；具體策略應按"case by case"原則科學制定，例如，以free形式作為臨床藥代動力學研究目標，但同時建立分析方法檢測發生ADA的試驗參與者的生物樣品，用以明確影響等。對于非臨床研究，一般而言認為，free型藥物濃度對PK評價更具意義，total型藥物濃度對毒代動力學（TK）評價更具意義，而bound型藥物濃度則與藥效更為相關[6]。 （3）檢測平臺與分析模式 在檢測平臺選擇上，配體結合試驗（ligand binding assay, LBA）、LC-MS/MS、LC-HRMS和流式細胞術仍是廣泛使用的生物分析工具。目前多采用LBA平臺上的酶聯免疫吸附法（ELISA）進行檢測，因其兼具高通量與高靈敏度的優勢，但方法性能亦取決于所選試劑的親和力大小[8]。 一般情況下，雙抗的PK定量可包括三類測定方法[7]： 1個雙功能方法（dual-functional assay）：需同時識別兩個活性結合域，通常以兩個靶點蛋白或抗獨特型抗體分別作為捕獲試劑和檢測試劑組合進行檢測； 2個單功能方法（mono-functional assay）：分別檢測兩個結合域之一，通常以其中一個靶點蛋白作為捕獲試劑、以抗人IgG作為檢測試劑。 考慮到雙抗作用機制和結構的復雜多變，傳統的橋聯式分析可能無法提供足夠的靈敏度和藥物耐受性，此時可選擇更多的分析格式和策略；除format設計外，還可采用特殊前處理方式（如酸化處理）打破bound型藥物分子與靶點/ADA 之間的連接，從而更靈活地實現total型藥物的檢測[7]。 （4）方法開發的關鍵考量 試劑兼容性與空間位阻：若雙抗同時靶向可溶性分子和細胞結合分子（細胞表面受體）以發揮預期藥理學活性，則藥物與生物分析試劑在檢測環境中可能發生不同的相互作用，開發中應驗證捕獲-檢測試劑對兒的兼容性，避免潛在的空間位阻效應； 生物轉化與穩定性：與傳統單抗相比，雙抗更易發生生物轉化或體內不穩定，而生物轉化可能影響分子活性及其檢測的可靠性，因此需評估基質中雙抗各形態的穩定性； 方法特異性：雙抗在體內的多樣性和結構復雜性可能誘導機體產生更為復雜的免疫原性，分析方法需充分考慮各功能域的特征，以及生物轉化或ADA對每個功能域的潛在干擾[7]。 （5）非臨床檢測策略的簡化 非臨床前健康動物體內靶點豐度較低，通常采用單一方法即可滿足檢測需求。從已上市雙抗的公開信息看，絕大多數產品在臨床前（動物 PK/TK）階段僅設置一個檢測項，即總抗（total）或完整分子（intact）檢測。 4.免疫原性及生物分析 雙抗結構為人工重構、非天然IgG，存在新的表位，免疫原性風險高于傳統單抗。中高滴度、持續性抗藥抗體（anti-drug antibody, ADA）可能導致藥物暴露下降、藥效（PD）信號丟失，因此不同階段的研究均需關注ADA的產生：臨床前研究階段，ADA分析可輔助PK/TK數據的解讀；臨床研究階段，則需根據實際情況進一步完善ADA或中和抗體（neutralizing antibody, NAb）的分析[9]-[10]。 （1）非中和型ADA：不直接阻斷藥效，但顯著干擾PK 加速藥物清除、縮短半衰期，谷濃度顯著下降； 導致個體間暴露差異增大，劑量-效應關系紊亂； 是雙抗"三套 PK"（total/free-X/intact）曲線分離的重要誘因之一。 （2）中和型 ADA（NAb）：直接中和藥物的藥理活性 阻斷單臂或雙臂的靶點結合能力； 破壞雙抗的協同作用機制，直接導致藥效失效； 高滴度NAb還可能引發超敏反應、輸注反應等免疫相關不良反應。 （3）ADA分析邏輯 分層評價：篩查陽性 → 確證陽性 → 滴度定量 → 中和活性 → 表位定位； 聯動PK/PD：判斷暴露下降是否由ADA導致； 關聯安全性：重點關注高滴度、早發ADA與不良反應的關聯； 對比基線預存抗體：排除本底干擾，區分治療誘導產生的ADA[10]。 4 結語 雙抗以“一個分子、兩個靶點”重構了抗體的作用方式，也把藥代研究推向了更高的復雜度：結構格式決定基礎的PK行為，體內多種分子形式的存在有時要求生物分析"多套并行"，免疫原性則是貫穿始終的變量。有濟醫藥具有完善的藥代動力學及生物分析平臺，同時具有多平臺PD biomarker及免疫毒相關細胞因子等檢測能力，為企業提供從早期分子到IND、NDA的全流程服務，助力雙抗項目高效推進。 參考文獻 1.K?hler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, 256(5517): 495-497. 2.Nisonoff A, Rivers MM. Recombination of a mixture of univalent antibody fragments of different specificity. Arch Biochem Biophys, 1961, 93(2): 460-462. 3.Labrijn AF, Janmaat ML, Reichert JM, et al. Bispecific antibodies: a mechanistic review of the clinic. Nat Rev Drug Discov, 2019, 18(8): 585-608. 4.國家藥品監督管理局藥品審評中心. 雙特異性抗體抗腫瘤藥物臨床研發技術指導原則. 2022. 5.Carter T, et al. Bispecific antibody PK considerations. Cancer J, 2020. 6.Zuch de Zafra FJ, et al. Strategic considerations for the discovery and validation of TAb and free drug assays for bispecific antibodies. Bioanalysis, 2023. 7.Strategies for bioanalytical method development of bispecific antibodies. Bioanalysis, 2023, 15(2): 75-92. 8.Ligand binding assay (LBA) modernization for bispecific antibodies. Workshop report, 2023. 9.Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations for bispecific antibodies in oncology. Clin Pharmacol Ther, 2023, 114(3): 530-543. 10.FDA. Guidance for Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products. 2014. 11.Phase 1, ?rst-in-human study of TYRP1-TCB (RO7293583), a novel TYRP1-targeting CD3 T-cell engager, in metastatic melanoma: active drug monitoring to assess the impact of immune response on drug exposure. Front. Oncol. 2024, 14: 1-15
